Op welke wijze kan men de betrouwbaarheid van een moleculaire bepaling borgen?

Waarden en voorkeuren

Niet van toepassing, omdat de aanbevelingen niet op het niveau van de individuele patiënt zijn.

Kosten en middelen

Validatie en verificatie voorafgaand aan de implementatie van een nieuwe bepaling brengen eenmalig kosten met zich mee. Het meenemen van positieve en negatieve controles in elke bepalings-run brengt structurele kosten met zich mee; zowel voor de controle als voor de extra testen die per run meegenomen worden. Het aanschaffen van externe positieve controles neemt i.h.a. meer kosten mee dan het zelf bereiden van positieve controles.

Het beoordelen van de continue geschiktheid van bepalingen door periodieke analyse van de testresultaten (trendanalyses) genereert geen extra kosten maar kost wel tijd. Participatie aan rondzendingen neemt eveneens kosten met zich mee.

De baten van controles en aanvullende maatregelen voor kwaliteitsborging zijn dat indien er afwijkingen in het proces zijn, deze tijdig opgemerkt kunnen worden en daarmee voorkomen kan worden dat verdere kosten gemaakt worden door het gebruik van minder betrouwbare diagnostiek.

Professioneel perspectief

Voor ingebruikname kwalitatieve/kwantitatieve moleculaire bepaling:

Voorafgaand aan de implementatie van een moleculaire bepaling dient te worden beoordeeld of de bepaling voldoet aan de criteria die vooraf zijn opgesteld. De criteria die worden opgesteld hangen af van de toepassing van de bepaling: De materiaalsoorten waarop de bepaling wordt toegepast, de variatie aan stammen of species die gedetecteerd dienen te worden, de benodigde sensitiviteit passend bij de indicatiestelling, de interacties die een mogelijke rol kunnen spelen in de betrouwbaarheid van het resultaat, enzovoort. De prestatiecriteria (eisen), de verslaglegging van methode en resultaten en de conclusie (voldoet de bepaling aan de eisen) worden vastgelegd in een validatie- of verificatierapport. Voor de prestatiecriteria die voorafgaand gesteld worden geldt:

Sensitiviteit, specificiteit, reproduceerbaarheid

Voor een moleculaire (kwalitatieve en kwantitatieve) bepaling dient in elk geval de sensitiviteit, de specificiteit en de reproduceerbaarheid beoordeeld te worden. Naast het bepalen van de analytische sensitiviteit, oftewel de detectielimiet, dient eveneens beoordeeld te worden of de sensitiviteit in de beoogde patiëntmaterialen passend is bij de indicatiestelling.

Voor het beoordelen van de specificiteit kan na een in silico beoordeling van de mogelijke interacties een panel getest worden dat representatief is voor de diagnostische toepassing.

De reproduceerbaarheid geeft informatie over de mogelijke verandering in het resultaat door kleine variaties in de uitvoering zoals bijvoorbeeld batch-to-batch verschillen en uitvoerder.

Andere prestatiecriteria, zoals genoemd in de ISO 15189 norm (juistheid, accuraatheid), kunnen afhankelijk van de bepaling nog bijdragen. Deze andere prestatiecriteria zijn veelal voor moleculaire bepalingen echter niet nodig om een compleet beeld van de geschiktheid van een bepaling te krijgen.

Aanvullend voor kwantitatieve bepalingen

Verder is het voor kwantitatieve bepalingen vereist om inzicht te hebben in de meetonzekerheid van de bepaling zodat een oordeel gegeven kan worden over de feitelijke gedetecteerde hoeveelheid, stijging en daling. Dit kan verricht worden door de standaardafwijking van de bepaling vast te stellen aan de hand van reproduceerbaarheidsexperimenten, bij voorkeur rondom de medische beslissingswaarde en zo nodig ook bij andere meetwaarden.

Reeds gevalideerde bepalingen

Hoe uitgebreid de validatie moet zijn hangt af van een eventueel vooraf verrichte validatie en de inzichtelijkheid daarvan. Bij een Lab Developed Test (LDT) is nog niets verricht en dient het laboratorium de gehele validatie uit te voeren. Bij een CE-IVD bepaling wordt al een uitgebreide validatie verricht door de fabrikant, waardoor (indien de bepaling zonder aanpassing wordt verricht) een verificatie in principe voldoende is. Dit kan gedaan worden door een controle op de sensitiviteit, de specificiteit en de reproduceerbaarheid. De toepassing kan echter vereisen dat er een aanvullende validatie nodig is, bijvoorbeeld indien de bepaling gebruikt zal worden voor een andere materiaalsoort dan getest tijdens de CE-IVD validatie, of bij een andere indicatiestelling. Andere voorbeelden zijn bepalingen gericht op a) een organisme dat sterk onderhevig is aan genetische drift of b) een lokale variant van een micro-organisme. In dat geval zal beoordeeld moeten worden of tijdens de validatie voldoende naar de verschillende (recente) varianten is gekeken. Oftewel, het laboratorium zal zelf moeten vaststellen op welke criteria een aanvullende validatie nodig is.

Aanpassingen aan een gevalideerde bepaling

Een aanvullende validatie kan ook nodig zijn bij gepubliceerde moleculaire bepalingen of CE-IVD bepalingen die enige aanpassing ondergaan (op iets andere wijze worden uitgevoerd). Denk hierbij aan het gebruik van een andere nucleïnezuurextractiemethode, of een extra interne controle. In die gevallen dient de verificatie aangevuld te worden met validatietesten die specifiek gericht zijn op het aantonen van het mogelijk ontstane verschil in prestatie.

Tijdens gebruik kwalitatieve/kwantitatieve moleculaire bepaling:

Positieve controle

Bij de uitvoering van een moleculaire bepaling dienen controles meegenomen te worden die de gehele uitvoering van het proces controleren. Een positieve controle wordt meegenomen om het hele proces, van isolatie tot detectie, te controleren. Criteria waaraan de uitkomst van de positieve controle moet voldoen dienen van te voren vastgesteld te worden. Veelal gebeurt dit aan de hand van het meermaals testen van de controle en het vaststellen van de gemiddelde waarde en de standaarddeviatie. Een hulp bij het vaststellen van acceptatiecriteria aan de hand van de positieve controle zijn de Westgard Rules.

Zowel bij kwalitatieve als kwantitatieve bepalingen worden positieve controles meegenomen. Bij kwantitatieve bepalingen kan de positieve controle ook dienen als kalibrator indien deze geijkt is aan een internationale standaard. Periodiek dient de kalibrator opnieuw geijkt te worden aan de internationale standaard om te controleren of de afgegeven kwantitatieve waarden nog correct zijn.

Bij batchgewijs testen dient in elke testrun een positieve controle te worden meegenomen. Tenslotte kan bij elke bepalingsrun iets mis gaan gedurende het proces waardoor de reactie niet goed verloopt. Een positieve controle maakt dit inzichtelijk.

Bij random-access apparatuur is het niet mogelijk in elke run een positieve controle mee te nemen. Een positieve controle dient dan regelmatig getest te worden.

De waarden van de controle in de tijd worden vastgelegd om daarmee trendanalyses te kunnen uitvoeren.

Negatieve controle

Een negatieve controle dient in elke run te worden meegenomen. Een negatieve controle dient bij voorkeur te bestaan uit een negatief monster voor het betreffende target. Indien een negatieve controle toch een positief resultaat geeft, kan dit duiden op contaminatie van één van de reagentia of ruimten, of op fouten bij het inzetten van de test. Het ondersteunt bij het inschatten van de betrouwbaarheid van een positief resultaat.

Bij batchgewijs testen dient in elke testrun een negatieve controle te worden meegenomen. Bij random-access apparatuur is het niet mogelijk in elke run een negatieve controle mee te nemen. Een negatieve controle dient dan regelmatig getest te worden.

Interne controle

Interne controles worden meegenomen om het proces per monster te controleren. Interne controles kunnen aan het te onderzoeken materiaal toegevoegd DNA, RNA of virussen zijn, of bv huishoudgenen voor het bepalen van de aanwezigheid van voldoende humaan DNA.

Een interne controle kan niet altijd aan het oorspronkelijke materiaal worden toegevoegd. De interne controle wordt in zulke gevallen na de isolatie maar voor de amplificatie toegevoegd. Afhankelijk van het moment van toevoegen wordt met een interne controle het proces per monster bewaakt op isolatie, cDNA synthese en de amplificatie. Indien er storende factoren in het opgewerkte materiaal aanwezig zijn die de effectieve detectie van het te onderzoeken micro organisme beperken, kunnen deze aan de hand van de interne controle opgemerkt worden.

Continue geschiktheid kwalitatieve/kwantitatieve moleculaire bepaling

De continue geschiktheid van moleculaire bepalingen wordt geborgd door:

• periodieke evaluatie van de positieve controles op trendafwijkingen,
• Periodieke analyse van gevonden resultaten,
• controle op contaminatie van de omgeving bij voorbeeld met behulp van veegproeven,
• periodieke controle van primers en probes op de op dat moment circulerende stammen,
• participatie aan interlaboratoriumvergelijkingen (zoals rondzendingen).

Door periodieke evaluatie van de waarde van de positieve controle in de tijd kunnen afwijkingen door bijvoorbeeld achteruitgang in reagentia of batchverschillen, tijdig worden herkend. Indien nodig kunnen maatregelen getroffen worden.

Ook de gevonden diagnostische resultaten geven informatie over de continue prestaties. Zo kan een daling in het aantal zwak positieve detecties een indicatie zijn voor een verminderde gevoeligheid en is een stijging van het aantal zwak positieven een indicatie voor een mogelijke contaminatie of voor aspecificiteit.

Sommige micro-organismen veranderen in de loop van de tijd door genetische shift en drift. Periodieke controle op de geschiktheid van de methode om de op dat moment circulerende stammen en varianten goed op te pikken is nodig om de geschiktheid van de bepaling te waarborgen. Dit kan bv in silico door te controleren of de in gebruik zijnde primers en probes nieuwe varianten oppikken, of in vitro op diagnostisch materiaal of stammen. De keuze van de frequentie van de controle kan afhankelijk zijn van de mutatiefrequentie en/of het ontstaan van recombinant stammen, etc. Het laboratorium dient hier zelf een beleid in te ontwikkelen.

Een rondzending kan informatie verschaffen over de specificiteit en geschiktheid van de bepaling voor het doel waarvoor deze wordt toegepast. Kies daarom voor participatie aan een rondzending die daarbij het beste past.

Voor alle andere moleculaire bepalingen, zoals verdere identificatie van micro-organismen of hun eigenschappen

Verdere identificaties, typeringen en resistentiebepalingen worden in het algemeen verricht op geamplificeerd materiaal of na verdere kweek. Het meenemen van positieve, negatieve en interne controles is dan niet altijd zinvol en niet altijd mogelijk. Het laboratorium dient zelf een beleid te maken waardoor de continue kwaliteit geborgd wordt, bijvoorbeeld door het periodiek testen van bekende stammen of varianten en/of participatie aan interlaboratoriumvergelijkingen.

Aanvaardbaarheid en haalbaarheid van de aanbeveling(en)

De aanbevelingen deze module sluiten grotendeels aan bij de ISO 15189 norm en de huidige praktijk, hetgeen aanvaardbaar en haalbaar zal zijn voor betrokken partijen.

Rationale van de aanbeveling(en)

Bij het opstellen van de aanbevelingen is veel gewicht toegekend aan het feit dat 1) een ingangsvalidatie en een validatie tijdens gebruik zekerheid geeft dat een diagnostische bepaling een betrouwbaar antwoord geeft op de diagnostische vraag; en 2) observaties tijdens gebruik noodzakelijk zijn voor betrouwbare diagnostiek.