Welke laboratoriummethodes worden gebruikt voor de detectie van metallo beta-lactamasen producerende P. aeruginosa?

Kwaliteit van bewijs

Niet van toepassing, omdat geen systematic review verricht is.

Kosten en middelen

Het toepassen van de aanbevelingen zal geen effect op de structurele kosten hebben, omdat de aanbevelingen grotendeels al aansluiten op de bestaande praktijk.

Professioneel perspectief

Screening op metallo beta-lactamasen producerende P. aeruginosa

Detectie van de aanwezigheid van metallo beta-lactamasen producerende P. aeruginosa bestaat ten eerste uit het screenen (herkennen) van de isolaten met verminderde gevoeligheid voor de carbapenems, zoals imipenem en meropenem. De gevoeligheid van imipenem wordt vergeleken met de MIC-verdeling voor imipenem van de “wild-type” populatie. Voor de screening word een breekpunt aangehouden van > 4 mg/L voor imipenem en eventueel > 2 mg voor meropenem. Het is gebleken dat voor de detectie van VIM metallo beta-lactamasen imipenem een betere indicator is dan meropenem (Knoester et al., 2014; van der Bij et al., 2011). Om de specificiteit van de confirmatie te verhogen wordt in de screening tevens meegenomen de ongevoeligheid voor tobramycine. Organismen die MICs hebben > 4 mg/L voor imipenem en ongevoelig zijn voor tobramycine dienen fenotypisch danwel genotypisch geconfirmeerd te worden op de aanwezigheid van een metallo beta-lactamase. Immers het VIM- en IMP-gen maken deel uit van een resistentiecassette waarin meestal ook gen(en) van aminoglycoside-modificerende enzymen zijn gelokaliseerd resulterend in resistentie tegen tobramycine (van der Zee A et al., 2018; Poirel et al., 2001; Zhao et al., 2009).

Fenotypische confirmatie

Voor de fenotypische confirmatie zijn meerdere opties beschikbaar. Bij de opkomst van metallo beta-lactamasen-producerende P. aeruginosa isolaten werd gebruikt gemaakt van inhibitie-assays waarbij de aktiviteit van het enzym werd geremd middels toevoeging van chelators (Pitout et al., 2005; Fournier et al., 2013). De afgeleide commerciële beschikbare gradientstrips bleken minder specifiek, waardoor organismen ten onrechte werden gerapporteerd als positief voor metallo-beta-lactamasen (Hansen et al., 2014; Samuelsen et al., 2008).

Echter bij P.aeruginosa wordt de laatste jaren steeds meer gebruik gemaakt van een aangepaste CIM-test of van de colorimetrische Carba NP test. Aanpassing van de CIM is nodig om een acceptabele sensitiviteit te bereiken. In de studie van Simner et al. werd een CIM-test uitgevoerd gebruik makend van een dikker inoculum. Door toepassing van deze variant werd een gemiddelde sensitiviteit en specificiteit behaald van respectievelijk 98% en 95% in een multicenter studie. In dezelfde studie werd ook de CarbaNP test geëvalueerd gebruikmakend van dezelfde set isolaten en werd een sensitiviteit van 97,8% en specificiteit van 97,8% gemeld (Simner et al., 2018).

De methode die momenteel al in de meeste laboratoria wordt toegepast is de gemodificeerde CIM-assay. Met deze assay wordt door afbraak van meropenem de aanwezigheid van het carbapenemase enzym aangetoond (van der Zwaluw et al., 2015). Echter om de gevoeligheid van de confirmatie van carbapenemasen in Pseudomonas aeruginosa te optimaliseren dient er wel een dikker inoculum te worden gebruikt (Simner et al., 2018).

De versie die gevalideerd is in het Erasmus Universitair Medisch Centrum (EMCR) om VIM-positieve P. aeruginosa isolaten te isoleren wordt hieronder beschreven.

Carbapenem Inactivation Method (CIM)

Principe

De CIM toont de inactivatie van meropenem door carbapenemase enzymen aan. Men brengt het te onderzoeken isolaat in een oplossing waaraan ook een meropenem-disk is toegevoegd. Na incubatie wordt de nog aanwezige hoeveelheid meropenem in de disk getest middels diffusie met een meropenem-gevoelige indicator E. coli. Indien meropenem in de disk is afgebroken dan zal de remzone significant kleiner zijn dan bij de controle waarbij geen afbraak heeft plaats gevonden. Bij een afname van de remzone van > 5 mm bij het verdachte isolaat in vergelijking met de controle, is de aanwezigheid van carbapenemase aktiviteit aangetoond.

Uitvoering

• vul voor de positieve controle, de negatieve controle en elk testisolaat een steriel eppendorf cupje met 400 ul steriel water.
• suspendeer met een swab het testisolaat, de positieve en negatieve controle in de afzonderlijke eppendorfcupjes. Let op: de dikte van de suspensie is essentieel. Deze dient meer dan 4 McFarland te bedragen.
• meng de suspensie door minimaal 10 seconden te vortexen
• voeg met een pincet aan alle suspensies een 10 µg meropenem-disk toe, dompel de disk onder door het buisje even te mengen op de vortex
• incubeer de suspensies 2 uur bij 35-37°C
• maak, vlak voordat de incubatie ten einde is, van de E. coli ATCC 25922 een gestandaardiseerd inoculum van 0.5 McFarland in fysiologisch zout; beënt hiermee een MH-agar plaat.
• breng met een steriele pincet de meropenem-disks over op de beënte MH-agar plaat. Voor het aanbrengen van de disk op de plaat dient het overtollige vocht nog aanwezig op de disk mbv tissue te worden weggehaald. Verdeel de diskjes evenredig over de beënte plaat.
• incubeer overnacht bij 35-37°C
• meet de remzones (diameter). Indien geen zone wordt gezien dan een waarde van 6 mm aanhouden.

Let op: rondom de disk kan soms groei van het testisolaat waarneembaar zijn, dit dient niet meegenomen te worden bij het opmeten van de zone, het gaat om de remzone van de E. coli ATCC 25922

Interpretatie

Indien er carbapenemase activiteit wordt gemeten dan is meropenem in het diskje afgebroken en is er doorgroei van het indicatorisolaat te zien tot aan de disk.

In sommige gevallen is de doorgroei van het indicator-organisme niet volledig tot aan de rand van disk. In dat geval is het resultaat dubieus. De remzone is wel kleiner dan de negatieve controle, namelijk deze is dan 4 mm of minder afgenomen ten op zichte van de negatieve controle. In dat geval dient de test herhaald te worden. Indien er 2 keer een dubieuze uitslag wordt gemeten dan dient de test als positief te worden beschouwd en kan het desbetreffend gen middels PCR of Whole Genome Sequencing (WGS) verder worden gekarakteriseerd.

Behalve bovengenoemde assay zijn er ook methoden beschikbaar waar de kleuromslag van een indicator wordt gebruikt om positieven van negatieven te onderscheiden. Deze assays zijn commercieel beschikbaar voor de confirmatie van metallo beta-lactamasen (Dortet et al., 2012; Kabir et al., 2016).

Echter het lijkt erop dat geen enkele van deze fenotypische assays een gevoeligheid haalt van 100% en de specificiteit ook soms te wensen overlaat. Men dient zich te realiseren dat geen van deze assays solitair als confirmatie gebruikt kunnen worden. Het verdient aanbeveling daarnaast nog een moleculaire confirmatie uit te voeren.

Genotypische confirmatie

De aanwezigheid van IMP- of VIM-genen kan worden bevestigd middels PCR of WGS. Alternatief is mogelijk waarbij gebruik wordt gemaakt van een hybridisatie-assay (Stuart et al., 2012). De meest prevalente IMP en VIM-varianten zullen worden opgepikt middels deze commerciële assays, echter bijzondere varianten kunnen worden gemist (Findlay et al., 2015). Bij discrepanties tussen de resultaten van de fenotypische confirmatie en PCR is het raadzaam WGS uit te voeren om evt. bijzondere genen aan te tonen.

De meest voorkomende metallo beta-lactamasen kunnen worden aangetoond middels commerciële PCR asssays. De meeste assays hebben de detectie van IMP en VIM in hun pakket, evenals NDM die ook in P. aeruginosa kan voorkomen (“Big Five”) (Girlich et al., 2020; Vanstone et al., 2018; Girlich et al., 2020).

Kwaliteitscontrole

Als controle isolaat wordt door EUCAST het gebruik van P. aeruginosa NCTC 13437 (VIM-10) voorgesteld. Lokaal fenotypisch en genotypisch gevalideerde referentiestammen zijn ook bruikbaar.

Aanvaardbaarheid/haalbaarheid van de aanbevelingen

Onderstaande aanbevelingen zijn haalbaar en aanvaardbaar voor medisch microbiologische laboratoria, omdat zij grotendeels aansluiten bij de huidige klinische praktijk.