Welke laboratoriummethodes worden gebruikt voor de detectie van ESBL producerende Enterobacterales?

Kwaliteit van bewijs

Niet van toepassing, omdat geen systematic review verricht is.

Kosten en middelen

Het toepassen van de aanbevelingen zal geen effect op de structurele kosten hebben, omdat de aanbevelingen grotendeels al aansluiten op de bestaande praktijk.

Professioneel perspectief

Leeswijzer: onderstaande tekst is als volg ingedeeld:

• Screening op ESBL-E
• Confirmatie van ESBL-E

 Fenotypische confirmatie

1. Combinatie disk diffusiemethode
2. Gradiëntmethode
3. Bouillon microdilutiemethode
4. Fenotypische confirmatie in groep I Enterobacterales
5. Fenotypische confirmatie in groep II Enterobacterales

 Genotypische confirmatie

• Kwaliteitscontrole

Screening op ESBL-E

Detectie van ESBL-E is een twee staps-procedure: een screeningstap gevolgd door een bevestigingstap (figuur 1). In de eerste stap wordt gescreend op de verminderde gevoeligheid voor een derde generatie cefalosporine. De gevoeligheid wordt vergeleken met deze van de ‘wild-type’ populatie. Het screening-breekpunt van > 1 mg / L is conform de richtlijnen van de CLSI en EUCAST (tabel 2) (CLSI 2011, EUCAST 2013).

Het wordt aanbevolen altijd gebruik te maken van 2 indicator cefalosporines; b.v. cefotaxim (of ceftriaxon) en ceftazidim. De reden voor gebruik van 2 cefalosporines is omdat de MICs voor de verschillende types ESBL verschillend kunnen zijn voor deze twee cefalosporines (Biedenbach et al., 2006; Hirakata et al., 2005, Hope et al., 2007; Kim et al., 2004]. Het gebruik van cefpodoxim als indicator cefalosporine is minder specifiek dan de combinatie van cefotaxim (of ceftriaxon) en ceftazidim en wordt niet aangeraden (Hope et al. 2007).

Figuur 1. Algoritme voor de detectie van ESBL-E

1 Gederepresseerde chromosomosomaal AmpC beta-lactamase gen kan resulteren in een fout-positief resultaat.

2 Als cefoxitine MIC >8mg/l, dan moet ESBL-bevestiging aanvullend worden uitgevoerd met cefepime als indicator

 cefalosporine.

3 Clavulaanzuur-resistente klasse D (OXA) ESBL kan niet worden uitgesloten.

4 Hyperproductie van K1 beta-lactamase in Klebsiella oxytoca kan resulteren in een fout-positief resultaat. Een positief testresultaat voor ceftazidim duidt op ESBL-productie.

Tabel 2. Screening op ESBL-E

MIC = minimal inhibitory concentration;

References: CLSI 2011, EUCAST 2013, Hope et al., 2007; Leverstein-van Hall et al., 2002, Spanu et al., 2006; Thomson et al., 2007

Confirmatiemehoden voor ESBL-E

Fenotypische confirmatie

De fenotypische confirmatiestap is gebaseerd op de in vitro remming van ESBL-activiteit door de toevoeging van clavulaanzuur. Alleen screening zonder confirmatie is onvoldoende voor een betrouwbare detectie van ESBL-E.

Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor de fenotypische confirmatie van ESBL-E. Deze zijn allemaal gebaseerd op de in vitro remming van ESBL-activiteit door clavulaanzuur. Drie methoden hebben hierbij de voorkeur: 1) de combinatie disk diffusiemethode, 2) de gradiëntmethode, of 3) bouillon microdilutiemethode (tabel 3) (Drieux et al., 2008; Jeong et al., 2009; Paterson et al., 2005). Vergeleken met de gradiëntmethode heeft de combinatie disk diffusiemethode een hogere specificiteit (Platteel et al., 2013)

De VITEK 2 ESBL bevestigingstest wordt niet aanbevolen voor ESBL confirmatie, omdat het aantal gegevens beperkt is en de gepubliceerde resultaten uiteenlopend zijn (Leverstein-van Hall et al., 2002; Spanu et al., 2006; Thomson et al., 2007). Bij de 'double disk approximation test' is de gevoeligheid afhankelijk van de optimale disk/tablet-afstand. Bovendien is in verschillende onderzoeken aangetoond dat de gevoeligheid hiervan laag is (Bedenic et al., 2007, Paterson et al., 2005, Tzelepi et al., 2000). Om die reden wordt afgeraden om de 'double disk approximation test' te gebruiken.

a) Combinatie disk diffusiemethode

Remmingszones rond cefalosporine disks/tabletten in combinatie met clavulaanzuur worden vergeleken met remmingszones rond de disks/tabletten met cefalosporines alleen. De test is positief als de remmingszone rond de disk/tablet met clavulaanzuur ³5 mm groter is dan rond de disk zonder clavulaanzuur (op voorwaarde dat de ESBL-screening positief is) (Tabel 3) (HPA 2008; M'Zali et al., 2000). Voor applicatie van de disks/tabletten wordt verwezen naar de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.

b) Gradiëntmethode

MICs van cefalosporine alleen worden vergeleken met MICs van cefalosporine gecombineerd met clavulaanzuur. De test is positief als de MIC van het cefalosporine met clavulaanzuur ³8 keer lager is dan de MIC van het cefalosporine alleen of bij aanwezigheid van een deformatie-ellips / fantoomzone (op voorwaarde dat de ESBL-screening positief is) (Tabel 3). Het testresultaat is niet interpreteerbaar als de strip niet kan worden afgelezen vanwege groei buiten bereik van de strip. Alle overige uitslagen zijn niet indicatief voor productie van ESBL. Voor applicatie van de gradiënttesten wordt verwezen naar de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. De gradiënttesten zijn niet te gebruiken voor het bepalen van de MIC.

c) Bouillon microdilutiemethode

MICs van cefalosporine alleen worden vergeleken met MICs van cefalosporine gecombineerd met clavulaanzuur. De test is positief als de MIC van het cefalosporine met clavulaanzuur ³8 keer lager is dan de MIC van het cefalosporine alleen (op voorwaarde dat de ESBL-screening positief is) (Tabel 3). Voor de uitvoering wordt aanbevolen om twee seriële tweevoudige verdunningen te maken van cefotaxim (of ceftriaxon), ceftazidim en cefepime in Mueller-Hinton-bouillon (concentratiereeks van 0,25 tot 512 mg/L) waarbij in een van de reeksen clavulaanzuur in een vaste concentratie van 4 mg/L is toegevoegd. Een bacteriesuspensie wordt in elk putje van de microtiterplaat geïnoculeerd (Jeong et al., 2009). De microtiterplaat wordt gedurende 18 tot 24 uur bij 37 ° C geïncubeerd.

Tabel 3. ESBL confirmatie methode voor Enterobacterales welke positief zijn in de ESBL screening (Zie Tabel 2)

ESBL = extended-spectrum beta-lactamase; MIC = minimal inhibitory concentration

1 MIC indicator cefalosporine / MIC indicator cefalosporine + clavulaanzuur

2 Indicator cefalosporine + clavulaanzuur ten opzichte van indicator cefalosporine alleen

Referenties: CLSI 2011, HPA 2006, Jeong 2009, M’Zali 2000, Paterson 2005, Stürenburg 2004

d) Fenotypische confirmatie in groep I Enterobacterales

Voor de definitie van groep I Enterobacterales: zie inleiding van de module ‘Extended-spectrum beta-lactamases / plasmidaal AmpC-detectie’.

Gebruik zowel cefotaxim (of ceftriaxon) als ceftazidim voor de bevestiging van ESBL in groep I Enterobacterales (Tabel 3), omdat de hydrolyse van de verschillende klassen van ESBLs voor cefotaxim en ceftazidim verschillend is. Synergie met clavulaanzuur van één van beide cefalosporines is voldoende om de aanwezigheid van ESBL te bevestigen (CLSI 2011).

Niet interpreteerbare testresultaten kunnen het gevolg zijn van de aanwezigheid van een carbapenemase-gen (March et al., 2010). Niet interpreteerbare testresultaten (gradiëntmethode) en fout-negatieve testresultaten (combinatie disk diffusiemethode, gradiëntmethode en bouillon microdilutiemethode) kunnen ook het gevolg zijn van de aanwezigheid van AmpC beta-lactamasen (Drieux et al., 2008; Jacoby et al., 2009; Munier et al., 2010). Een cefoxitine MIC >8 mg / L is vaak indicatief voor stabiele derepressie van het AmpC betalactamase-gen (Jacoby et al., 2009). Als de testresultaten voor cefotaxim (of ceftriaxon) of ceftazidim niet interpreteerbaar zijn (gradiëntmethode) of als het isolaat een cefoxitine MIC >8 mg / L heeft, wordt het daarom aanbevolen om een ​​extra ESBL-bevestigingstest uit te voeren met cefepime als indicator cefalosporine. Reden hiervoor is dat cefepime niet afgebroken wordt door AmpC beta-lactamasen (Drieux et al., 2008).

Een alternatieve methode om het maskerende effect van AmpC te voorkomen is om de combinatie disk diffusie methode uit te voeren op Mueller-Hinton agar platen die 200-250 mg/L cloxacilline bevatten (Drieux et al., 2008). Cloxacilline werkt als remmer van AmpC beta-lactamasen. Voor een ander alternatief, het gebruik van disks die naast de indicator antibiotica (cefotaxim en ceftazidim +/- clavulaanzuur) tevens cloxacilline bevatten, zijn onvoldoende gepubliceerde validaties beschikbaar.

Andere oorzaken van fout-negatieve testresultaten zijn de aanwezigheid van clavulaanzuur-ongevoelige klasse D (OXA) ESBL's (Naas et al., 2008) of clavulaanzuur-ongevoelige TEM beta-lactamasen (Sirot et al., 1997).

ESBL-confirmatietesten die cefotaxime als indicator cefalosporine gebruiken, kunnen fout-positief zijn in Klebsiella oxytoca-stammen met hyperproductie van het chromosomale K1 beta-lactamase (Livermore et al., 1995; Paterson et al., 2005; Sanders et al., 1996). Daarom is bij K. oxytoca-isolaten die een positief fenotypisch ESBL-confirmatietestresultaat hebben, genotypische ESBL-confirmatie aanbevolen, tenzij sprake is van een verhoogde ceftazidime MIC en ceftazidim-clavulaanzuur confirmatie test. Dan is er sprake van ESBL productie. K1 hydrolyseert immers geen ceftazidim. Een soortgelijk fenotype kan ook worden aangetroffen in Proteus vulgaris, Proteus penneri, Citrobacter koseri en Kluyvera spp. en in sommige C. koseri-verwante soorten zoals C.sedlakii, C.farmeri en C.amalonaticus, die chromosomale beta-lactamasen hebben die eveneens worden geremd door clavulaanzuur (Petrella et al., 2006; Stürenburg et al., 2004).

Andere minder vaak voorkomende oorzaken van fout-positieve testresultaten zijn hyperproductie van SHV-1 beta-lactamasen in Klebsiella pneumoniae of de aanwezigheid van klasse A-carbapenemasen (inclusief KPC) (Nordmann et al., 2009; Wu et al., 2001).

e) Fenotypische confirmatie in groep II Enterobacterales

De synergie tussen indicator cefalosporine en clavulaanzuur kan gemaskeerd worden door de aanwezigheid van chromosomale AmpC beta-lactamasen.

Cefepime + clavulaanzuur kan voor confirmatie gebruikt worden, omdat cefepime niet wordt afgebroken door chromosomale AmpC beta-lactamasen. Ter confirmatie van ESBL in groep II Enterobacterales kan de combinatiedisk, gradient-, of bouillon microdilutie methode worden toegepast met cefepime als susbstraat (Cohen Stuart et al., 2011; Stürenburg et al., 2004; Towne et al., 2010) (Tabel 3).

Een alternatieve methode om het maskerende effect van AmpC te voorkomen is om de combinatie disk diffusie of gradientmethode uit te voeren op Mueller-Hinton agar platen die 200-250 mg/L cloxacilline bevatten (Drieux et al., 2008), met cefotaxim en ceftazidim als substraat. Cloxacilline werkt als remmer van AmpC beta-lactamasen. Voor een ander alternatief, het gebruik van disks die naast de indicator antibiotica (cefotaxim en ceftazidim +/- clavulaanzuur) tevens cloxacilline bevatten, zijn onvoldoende gepubliceerde validaties beschikbaar.

Genotypische confirmatie

Bevestig de aanwezigheid van ESBL-genen door middel van PCR- en/of ESBL-gensequencing (Bradford et al., 2001) of een op DNA-microarray gebaseerde methode (Cohen Stuart et al., 2010; Endimiani et al., 2010; Naas et al., 2010; Platteel et al., 2011; Willemsen et al., 2011). Met deze technieken worden fout-positieve uitslagen voorkomen. Deze moleculaire methodes maken gebruik van panels van targets, waarin de meest voorkomende ESBLs-genen als target zijn opgenomen. Enkele minder vaak voorkomende ESBL-types zijn niet als target aanwezig in deze panels, hetgeen kan resulteren in fout-negatieve genotypering. Detectie van deze zeldzame ESBLs is wel mogelijk door middel van whole genome sequencing.

Kwaliteitscontrole

Gebruik K. pneumoniae ATCC 700603 (ESBL-positief), E. coli ATCC 25922 (ESBL-negatief) en Enterobacter cloacae NCTC 13464 (ESBL-positief) als kwaliteitscontrole. Dit zijn internationaal erkende referentiestammen voor de kwaliteitscontrole voor ESBL-detectie. Lokaal fenotypisch en genotypisch gevalideerde referentiestammen zijn ook bruikbaar.

Aanvaardbaarheid/haalbaarheid van de aanbeveling(en)

Onderstaande aanbevelingen zijn haalbaar en aanvaardbaar voor medisch microbiologische laboratoria, omdat zij grotendeels aansluiten bij de huidige klinische praktijk.