Algemene inleiding

Aanleiding voor het maken van de richtlijn

Sinds 2008 is het grootste deel van het microscopisch chromosomenonderzoek geleidelijk vervangen door de genoombrede array diagnostiek als methode van eerste keus voor het opsporen van ongebalanceerde chromosomale afwijkingen (zie verderop in dit hoofdstuk voor achtergrondinformatie). Tot op heden zijn er geen kwaliteitscriteria gedefinieerd voor de pre- en post-test counseling. Er zijn bijvoorbeeld geen afspraken over welke chromosomale afwijkingen (kopie-aantal veranderingen, copy number variations, CNVs), vastgesteld met behulp van array of een next generation sequencing (NGS) techniek, wel of niet gecommuniceerd worden naar aanvrager en de patiënt. Ook is er onduidelijkheid over voor welke bevindingen vooraf toestemming aan de patiënt gevraagd moet worden. Het betreft hierbij onder andere de bevindingen die klinisch relevant (kunnen) zijn, maar die geen relatie hebben met de oorspronkelijke diagnostische vraag. Voorbeelden zijn deleties van tumor-suppressor genen of deleties van recessieve genen. In de prenatale setting komen daar tevens de bevindingen bij die een klinisch zeer variabele presentatie hebben, maar de echoscopische afwijkingen bij het ongeboren kind niet kunnen verklaren. Een voorbeeld zijn CNVs die een verhoogde kans geven op ontwikkelingsachterstand, maar ook voor kunnen komen bij personen zonder problemen. Er is bij de beroepsgroep duidelijk behoefte aan een eenduidig beleid. De kwaliteit van zorg en patiëntveiligheid zijn gebaat bij kwaliteitscriteria ten aanzien van pre- en post-test counseling en ten aanzien van informatiemateriaal voor patiënten.

In het op 6 mei 2014 aan de minister aangeboden rapport van de Gezondheidsraad “Nevenbevindingen bij diagnostiek in de patiëntenzorg” staan aanbevelingen, die ook voor deze richtlijn van toepassing zijn [GR Nr. 2014/13]. Deze, in dezelfde periode geschreven, richtlijn sluit in ieder geval aan op de aanbeveling dat beroepsgroepen richtlijnen moeten ontwikkelen voor het omgaan met nevenbevindingen. Waar van toepassing zal in deze richtlijn verwezen worden naar het rapport van de Gezondheidsraad.

Doel van de richtlijn

Het doel van de richtlijn is het definiëren van voorwaarden waaraan de pre- en post-test counseling moet voldoen in zowel de prenatale als postnatale situatie. Omdat zowel aanvragers, klinische omstandigheden en patiëntengroep in beide situaties wezenlijk verschillend zijn, is ervoor gekozen pre- en postnatale situatie apart te behandelen. Niet te vermijden was dat in de betreffende hoofdstukken veel overlap zit. Wij hebben ervoor gekozen dat zo te laten, zodat de hoofdstukken door de gebruikers als een op zichzelf staand hoofdstuk gelezen kunnen worden.

Leeswijzer

In verband met snel veranderende technieken zal in deze richtlijn verder gesproken worden over CNV-detectie diagnostiek (in plaats van microarray diagnostiek), waarbij wordt uitgegaan van een resolutie van tenminste 200kb (Vermeesch, 2012).

In dit hoofdstuk (Algemene inleiding en achtergrondinformatie) geven wij enige beknopte achtergrondinformatie ten aanzien van de plaats van CNV-detectie binnen de algemene diagnostiek, een korte beschrijving van de verschillende vormen van CNV-detectie diagnostiek en enkele technische aspecten.

In hoofdstuk 2 (Verantwoording) komen doel, doelgroep en afbakening van de richtlijn aan de orde. Ook wordt de gebruikte werkwijze bij het tot stand komen van de richtlijn besproken.

Voordat wordt overgegaan tot pre-testcounseling is het belangrijk de indicaties voor CNV-detectie diagnostiek te kennen. In de hoofdstukken 3 (Prenatale indicaties) en 4 (Postnatale indicaties) worden deze gedefinieerd voor respectievelijk de pre- en postnatale situatie.

In hoofdstuk 5 (Aanvragers) wordt ingegaan op de vraag welke hulpverleners CNV-detectie diagnostiek mogen aanvragen.

Voor zowel de pre- als de post-test counseling is het belangrijk op de hoogte te zijn van de mogelijke uitkomsten van CNV-detectie diagnostiek. Deze mogelijke uitkomsten worden, inclusief beknopte achtergrondinformatie, omschreven in hoofdstuk 6 (Mogelijke uitkomsten en rapportage door het laboratorium). Hierbij wordt ook de rapportage van deze uitkomsten besproken. Tevens wordt aangegeven wanneer laboratorium en aanvrager dienen te overleggen en wanneer bespreking in een commissie nodig wordt geacht (bij nevenbevindingen). Het gaat hierbij over de communicatie tussen laboratorium en aanvrager. De volgende hoofdstukken gaan over de communicatie tussen aanvrager en patiënt: in hoofdstuk 7 (Prenatale counseling) de prenatale en in hoofdstuk 8 (Postnatale counseling) de postnatale pre- en post-test counseling.

De snelle toename in kennis over de klinische betekenis van CNVs maakt dat de interpretatie van een uitslag in de loop der tijd kan wijzigen. Daarom is het belangrijk dat er ook afspraken worden gemaakt ten aanzien van het beleid rond follow-up en hernieuwd contact. Deze staan beschreven in hoofdstuk 9 (Follow-up en beleid rondom hernieuwd contact).

Tot slot heeft de werkgroep knelpunten en kennishiaten geconstateerd (zie bijlagen), die nu en in de toekomst aandacht verdienen. Naar aanleiding van de richtlijn zijn ook kwaliteitsindicatoren geformuleerd (zie bijlage) en wordt er landelijke patiënten informatie ontwikkeld.

Achtergrondinformatie

Plaats van CNV-detectie diagnostiek

Het gebruik van CNV-detectie diagnostiek met een resolutie van tenminste 200 kb (Vermeesch, 2012), in plaats van microscopische karyotypering, voor het opsporen van chromosomale veranderingen als oorzaak voor aangeboren afwijkingen, verstandelijke beperking en gedragsstoornissen heeft als belangrijkste voordelen:

Het kunnen opsporen van veel kleinere afwijkingen en daarmee het kunnen stellen van meer oorzakelijke diagnoses;
Het veel nauwkeuriger kunnen bepalen van de afwijkingen en daarmee het beter kunnen counselen van families.

Bijkomende voordelen zijn het beter kunnen automatiseren en vaststellen van de kwaliteit van het onderzoek. Door de meer objectieve karakterisering – het meten van relatieve hoeveelheden stukjes DNA ten opzichte van het visueel beoordelen van een microscopische opname – kunnen de bevindingen makkelijker onderling vergeleken worden. Door de beschikbaarheid van internationale databases neemt de kennis over de betekenis van kleine chromosomale afwijkingen, gedetecteerd als CNVs snel toe.

De meest gebruikte technieken voor CNV-detectie diagnostiek zijn op dit moment oligonucleotide array-CGH en SNP-array. Afwijkingen die niet met de array kunnen worden aangetoond zijn gebalanceerde chromosoomafwijkingen en laag-gradige mozaïeken. Hiervoor is respectievelijk microscopische karyotypering en FISH-onderzoek nodig. Ook afwijkingen onder de resolutiegrens (variërend per array-platform) en puntmutaties zijn niet met array op te sporen. De geëigende technieken hiervoor zijn MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) en DNA sequencing. Voor andere afwijkingen geldt dat ze wel met een SNP-array, maar niet met een oligo-array aan te tonen zijn: triploïdie en uniparentale disomie gebaseerd op heterodisomie. Voor een overzicht van de genetische afwijkingen die niet met array kunnen worden opgespoord zie het addendum bij dit hoofdstuk.

De laatste jaren zijn ook NGS technieken beschikbaar gekomen voor CNV-detectie. Deze richtlijn omschrijft het counselingbeleid rondom CNV-detectie diagnostiek, hieronder vallen dus array-diagnostiek en CNV-detectie middels NGS-technieken. Met NGS-technieken kunnen tevens puntmutaties worden opgespoord, maar dat valt buiten deze richtlijn.

Vormen van CNV-detectie diagnostiek

CNVs kunnen gedetecteerd worden middels array-diagnostiek en genoombrede NGS technieken. Afhankelijk van het gebruikte type array-platform wordt wel (SNP-array) of geen (array-CGH) haplotype-informatie verkregen. Haplotype-informatie kan een indicatie geven voor uniparentale disomie (UPD) en consanguiniteit. Indien ook de ouders worden onderzocht, kan tevens de parentale herkomst van de novo CNVs met SNP-array worden bepaald. Als nevenbevinding kan non-paterniteit worden vastgesteld.

Array-CGH

Bij array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) wordt het DNA van een patiënt vergeleken met dat van gezonde personen. Verspreid over het hele genoom worden hiervoor tien- tot honderdduizenden meetpunten (kleine stukjes DNA = oligonucleotiden, probes) bekeken. Door het kwantitatief vergelijken van fluorescent gelabeld DNA van een patiënt, met fluorescent gelabeld DNA van gezonde controle personen, kan voor elk meetpunt (oligonucleotide/probe) bepaald worden of bij de patiënt het normale aantal kopieën aanwezig is. Als er één of meer kopieën te weinig (bij een deletie/loss) of te veel (bij een duplicatie/gain) zijn in het genomisch materiaal van de patiënt, dan leidt dit tot een respectievelijk verlaagd of verhoogd signaal van de betreffende array probes ten opzichte van de controle (Zwijnenburg, 2014).

SNP-array

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) zijn (onschuldige) variaties in het genoom die steeds een enkele nucleotide betreffen en die kunnen verschillen tussen individuen. Bij SNP-arrays wordt een identieke procedure gehanteerd als bij de hierboven beschreven array-CGH. Vele honderdduizenden SNP probes bepalen de relatieve kopie aantallen van een patiënt ten opzichte van gezonde controles door het vergelijken van signalen, waardoor deleties en duplicaties kunnen worden opgespoord. Bij een SNP-array zijn de array probes echter zo gekozen dat er naast de informatie over de relatieve hoeveelheid DNA materiaal, ook informatie gegeven wordt over de SNP op deze positie. Op deze manier worden tienduizenden tot vele honderdduizenden SNPs verspreid over het genoom getypeerd. Deze SNP-typering (het haplotype) kan gebruikt worden als een interne bevestiging van een vastgestelde CNV, maar belangrijker, behalve deleties en duplicaties kunnen ook zogenaamde homozygote gebieden geïdentificeerd worden. In homozygote regio’s wordt bij een grote serie van opeenvolgende SNPs steeds hetzelfde allel in tweevoud gemeten; op het chromosoom van maternale afkomst zijn de SNPs dan identiek aan de SNPs op het chromosoom van paternale afkomst. Deze homozygote gebieden worden ook wel regions of homozygosity (ROH) genoemd. De identificatie van veel grote gebieden van homozygotie is een aanwijzing voor verwantschap (consanguiniteit) tussen de ouders van de onderzochte patiënt. Homozygote gebieden groter dan >5-10Mb zijn zeer uitzonderlijk bij kinderen van ouders zonder bloedverwantschap (Wang, 2014). Grote ROHs beperkt tot één chromosoom duiden op de mogelijkheid van uniparentale disomie: de herkomst van beide chromosomen van een paar van één ouder. Verder kunnen ROHs richting geven aan verdere diagnostiek bij verdenking op een recessief ziektebeeld. Er zijn hulpmiddelen waarmee in ROH-gebieden gezocht kan worden naar Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) genen, die geassocieerd zijn met een specifiek fenotype (Wierenga, 2013).

Combinatie arrays

De laatste generatie arrays bevatten vaak een combinatie van probes die alleen de kopie aantallen bepalen (copy-number probes) én probes die kopie aantallen en SNP-typeringsinformatie genereren (SNP-probes). Deze combinatie zorgt voor een hoge resolutie met een gelijkmatige genomische dekking én haplotyperings informatie (Zwijnenburg, 2014).

CNV-detectie middels next generation sequencing

CNV-analyse kan ook worden verricht op de data verkregen met genoombrede NGS. Met NGS technieken worden de sequentievolgordes van miljoenen korte stukken DNA bepaald. Hoe vaker een sequentievolgorde van een specifiek DNA fragment wordt bepaald bij een NGS analyse, hoe betrouwbaarder deze data wordt beschouwd. Dit wordt de read-depth (sequentie diepte) genoemd.

Er zijn twee verschillende soorten NGS technieken: de sequentie analyse van kort unieke sequenties (short reads) en de paired-end analyse waarbij de sequentie volgorden worden bepaald aan weerszijden van een groter stuk DNA, waarbij de afstand tussen die gepaarde sequenties bekend is.

CNV-analyse op short-read data is gebaseerd op het vergelijken van de relatieve sequentie diepte ten opzichte van referentie data. In het geval van een chromosomale deletie, zal de relatieve sequentie diepte in de betreffende regio lager zijn ten opzichte van referentie data. Bij een duplicatie zal de relatieve sequentie diepte juist hoger zijn.

CNV-analyse op paired-end data is gebaseerd op het vaststellen van een verandering in de bekende afstand tussen de gepaarde sequenties. Door het meten van de grootte van de afstandsverandering kan worden bepaald welke deletie of duplicatie in het onderzochte DNA monster aanwezig is. Bovendien kunnen in de data van de paired-end analyses chromosomale afwijkingen zoals inserties, inversies of translocaties worden gedetecteerd aangezien dit ook leidt tot een verstoring van de op voorhand verwachte lengte en afstand van de read-pairs.

Technische aspecten CNV-detectie diagnostiek

Aanvragen

Voor deze diagnostiek is DNA nodig. Dit kan uit verschillende weefsels verkregen worden. Meest gebruikt zijn perifeer bloed (EDTA), huid, vruchtwater en chorionvlokken. De aanvrager is verantwoordelijk voor het goed aanleveren van het juiste materiaal, alsmede voor de voor de interpretatie van de uitslag benodigde klinische informatie. Het laboratorium dient hiervoor eenduidige instructies op het aanvraagformulier te plaatsen.

Technische uitvoering

De kwaliteit van het onderzoek is de verantwoordelijkheid van de genetische laboratoria, verenigd in de Vereniging Klinische Genetische Laboratoriumdiagnostiek (VKGL) en dient minimaal te voldoen aan de internationale richtlijnen die hierover bestaan. Onafhankelijk van het gebuikte platform is de (rapportage)resolutie minimaal 200 kb (Vermeesch, 2012).

Interpretatie van de bevindingen

Ook de interpretatie van de bevindingen is de verantwoordelijkheid van de genetische laboratoria (VKGL), waarbij zij indien nodig klinisch genetici consulteren. Voor de interpretatie zijn klinische gegevens onontbeerlijk. Dit is de verantwoordelijkheid van de aanvrager.

Er zijn diverse publicaties waarin richtlijnen worden gegeven voor de interpretatie (Hehir-Kwa, 2013; Palmer, 2014; Riggs, 2012; Srebniak, 2014) en tevens kan gebruik gemaakt worden van web-based databases (De Leeuw, 2012). Zie verder Hoofdstuk 6 over de mogelijke uitkomsten van CNV-detectie diagnostiek.

Uitslagrapportage

Het uitslagrapport dient te voldoen aan de internationale richtlijn, zoals getoetst middels External Quality Assessments (EQA) en beschreven in een publicatie van Claustres et al. (2014).

Belangrijk punt hierbij is de interpretatie en beschrijving van de gevonden CNVs, alsmede welke CNVs wel en niet in de uitslag dienen te worden vermeld. Uniformiteit in de manier van rapporteren van met name de bevindingen met onduidelijke klinische relevantie is wenselijk en dit heeft de aandacht van de VKGL. Welke bevindingen in de uitslag dienen te komen, is van primair belang voor de pre- en post-test counseling. Wat de aanvrager wil weten, bepaalt mede wat er in de uitslag hoort te komen. In hoofdstuk 6 wordt mede ingegaan op het belang van communicatie tussen laboratorium en aanvrager.