Het cryopreserveren van embryo's is een techniek die al vele jaren tot het standaard verrichtingenpakket van IVF-centra behoort. Waar vroeger embryo's doorgaans met behulp van slow-freezing technieken werden ingevroren, is de vitrificatie (d.w.z. het ultrasnel invriezen) van embryo's steeds meer in opkomst. Voor beide manieren van invriezen bestaan vele verschillende laboratoriumprotocollen. De verschillen tussen verschillende protocollen hebben onder meer betrekking op het gebruik van verschillende typen en concentraties cryoprotectans (bv. DMSO, propaandiol, glycerol, ethyleen glycol), en het ontwikkelingsstadium waarin het embryo zich bevindt wanneer het wordt ingevroren (zygote, klievingsstadium op dag 2 of dag 3, of blastocyststadium op dag 5 of dag 6).

Aangezien, voor zover bij de werkgroep bekend, in Nederland geen zygotes worden ingevroren, beperkt de samenvatting van de literatuur zich tot embryo's die worden ingevroren in het klievings- dan wel in het blastocyststadium. Het cryopreserveren van oöcyten is een techniek die minder lang wordt toegepast dan het invriezen van embryo's. Het relatief grote volume van een oöcyt ten opzichte van de blastomeren van een embryo maakte de gebruikelijke slow freezing protocollen minder geschikt voor oöcyten. De cryopreservatie van oöcyten is door de introductie van vitrificatie echter in een stroomversnelling gekomen. Hoewel slow freezing van oöcyten nog wel gebeurt [Paramanantham 2015 (1)], is vitrificatie veruit de meest gebruikte invriesmethode.

Er zijn veel verschillende vitrificatiemethodes. Naast verschillen in de gebruikte soorten en/of concentraties van cryoprotectans, is een belangrijke factor het gebruik van open of gesloten systemen (zie verder bij Overwegingen).

Het is aannemelijk dat er geen (klinisch relevante) grote verschillen bestaan tussen de zwangerschapskans na cryopreservatie van klievingsstadium embryo's vs. cryopreservatie van blastocysten.
Edgar en Gook 2012 (8), Abdelhafez 2010 (7)

Het is aannemelijk dat de resultaten (zwangerschapskans) van slow freezing vs. vitrificatie van klievingsstadium embryo's vergelijkbaar zijn.
Edgar en Gook 2012 (8)

Het is aannemelijk dat de resultaten (zwangerschapskans) van gevitrificeerde blastocysten beter zijn dan die van slow frozen blastocysten.
Edgar en Gook 2012 (8)

Het is aannemelijk dat gevitrificeerde oöcyten voor wat betreft overlevingskans na ontdooiing, bevruchting na ICSI, embryo-ontwikkeling en kans op zwangerschap beter presteren dan slow frozen oöcyten.
Cobo en Diaz 2011 (9), Levi Setti 2014 (11)

De voor- en nadelen van open vs. gesloten vitrificatiesystemen voor oöcyten zijn op dit moment nog onvoldoende onderzocht. Elk laboratorium dient hierin zijn eigen afwegingen te maken.

Mening van de werkgroep

Algemeen
Wanneer men (de klinische waarde van) verschillende invriestechnieken wil vergelijken, is het zinvol om eerst te definiëren wat de Key Performance Indicators (KPI's) van een succesvolle embryo- cryopreservatie zijn. Een werkgroep van Alpha Scientists in Reproductive Medicine [Balaban 2012 (2)] heeft hiervoor een aantal aanbevelingen gedaan. Voor embryo's zijn dit onder meer percentage overleving na invriezen en ontdooien, dóórdeling van de embryo's na ontdooien, en de implantatierate. Voor oöcyten worden het percentage overlevende oöcyten na ontdooiing, het bevruchtingspercentage na ICSI, en het percentage doordelende embryo's na ICSI als KPI geadviseerd. Probleem is dat deze KPI's sterk worden beïnvloed door onder meer de leeftijd van de vrouw, het gebruikte stimulatieprotocol, en de gehanteerde selectiecriteria voor cryopreservatie.

De richtlijnen van de ASRM (2005 (3) en 2013 (4)) en ASCO (2006 (5) en 2013 (6)) doen geen uitspraken over de meest geschikte methode van embryo- dan wel oöcyt- cryopreservatie.

Embryo's
Het vergelijken van verschillende studies om de meest optimale cryopreservatie methode voor embryo's te bepalen, is een niet geringe opgave. RCT's waarin verschillende invriesprotocollen met elkaar worden vergeleken zijn schaars. Abdelhafez (2010 (7)) heeft 6 RCT's besproken waarin verschillende invriesmethodes voor embryo's (slow freezing, vitrificatie en ultra-rapid freezing, waarbij ultra-rapid freezing een soort tussenweg is tussen slow freezing en vitrificatie, met een minder snelle temperatuurdaling en lagere concentraties cryoprotectans dan vitrificatie) worden vergeleken. De kwaliteit van de RCT's wordt (op basis van kwaliteitscriteria opgesteld door het Cochrane Institute) als wisselend maar in het algemeen als matig tot zeer matig beoordeeld. Op de 6 RCT's is vervolgens een meta-analyse uitgevoerd. De resultaten voor wat betreft klinische zwangerschap, doorgaande zwangerschap en implantatie kans zijn ternauwernood significant beter voor vitrificatie ten opzichte van slow freezing (odds ratio's met 95% betrouwbaarheidsinterval van respectievelijk 1,55 (1,03-2,32), 1,82 (1,04-3,20) en 1,49 (1,03-2,15). De resultaten van ultra rapid freezing waren significant slechter dan die van slow freezing.

Edgar en Gook (2012 (8)) vonden 900 geschikte artikelen waaronder 4 RCT's die aan de gestelde criteria voldeden; 2 RCT's die slow freezing en vitrificatie protocollen vergeleken bij cleavage stadium embryo's, 1 RCT idem met blastocysten, en 1 RCT waarbij zowel cleavage stadium als blastocysten werden vergeleken. De resultaten met cleavage stadium embryo's lijken licht verbeterd na vitrificatie voor wat betreft de embryo survival rate na ontdooien (slow freezing vs. vitrificatie in 3 RCT's: 91 vs. 98%, 87 vs. 93% en 89 vs. 95%). De implantatiekans lijkt in 1 studie iets gunstiger voor slow frozen embryo's (32 vs. 27%, 13,5 vs. 14,3% en 1 maal niet getoond). Voor blastocysten lijkt vitrificatie in de 2 onderzochte RCT's betere resultaten op te leveren voor zowel embryo survival rate na ontdooien (slow freezing vs. vitrificatie) 91,4 vs. 95,9%, en 84 vs. 90% als voor de implantatie kans (29,6 vs. 33,4% en 51 vs. 53%). Of deze resultaten statistisch verschillend zijn is niet bekend, aangezien een meta-analyse niet is uitgevoerd.

In het 2007 door NVOG en KLEM gezamenlijk opgestelde advies betreffende vitrificatie van oöcyten en embryo's, concludeert men dat vitrificatie een veilige methode voor het invriezen van humane oöcyten en embryo's lijkt, ongeacht het stadium. Tevens concludeert de commissie echter dat de effectiviteit en veiligheid van vitrificatie middels RCT's onderzocht dient te worden, en tevens dat de follow-up van kinderen die geboren zijn uit gevitrificeerde embryo's bestudeerd dient te worden. Hoewel het advies toe is aan revisie, is de conclusie van de commissie dat veiligheid en effectiviteit van vitrificatie middels RCT's onderzocht dient te worden nog steeds actueel. Hetzelfde geldt voor de follow-up van kinderen die geboren worden uit gevitrificeerde embryo's of eicellen.

Samengevat: er is slechts een zeer beperkt aantal betrouwbare vergelijkende studies verschenen. Deze studies zijn eerder illustratief voor een grote inter-laboratorium variatie, dan dat zij duidelijk in de richting van een optimale werkwijze voor het invriezen van embryo's wijzen.

Oöcyten
De meeste studies gebruiken niet de door de Alpha werkgroep geadviseerde KPI's. Zo wordt in de meta-analyse die uitgevoerd werd door Cobo en Diaz (2011 (9)), het percentage doorgaande zwangerschappen als primaire uitkomstmaat gehanteerd, alsmede een aantal secundaire uitkomstmaten (klinische zwangerschap, implantation rate, overleving na ontdooien, bevruchtingspercentage en embryo ontwikkeling). In 5 RCT's werd minimaal één van bovengenoemde uitkomstmaten gepubliceerd. In deze 5 studies werden (de resultaten behaald met) in totaal 4.282 gevitrificeerde oöcyten, 361 slow-frozen oöcyten, en 3.524 verse cycli geanalyseerd. De vergelijking tussen gevitrificeerde en slow-frozen oöcyten voor wat betreft kans op een klinische zwangerschap viel uit in het voordeel van de eerste groep, hoewel geen statistische significantie werd bereikt (38,3% vs. 21,0%; OR 2,31; 95%CI 0,67-8,12). Wanneer de kans op klinische zwangerschap werd uitgerekend per ontdooide oöcyt, was dit wel significant beter voor gevitrificeerde oöcyten (5,2% vs. 1,7%; OR 3,18; 95%CI 1,06-9,52; p<0,05). Oöcytoverleving en bevruchtingspercentages waren beter met gevitrificeerde oöcyten vs. slow-frozen oöcyten (OR 2,46; 95%CI 1,82-3,32; p<0,00001 en OR 1,50; 95%CI 1,07-2,11; p<0,05, respectievelijk). Het percentage top embryo's was vergelijkbaar tussen verse oöcyten en gevitrificeerde oöcyten. De studie concludeert dat het biologisch potentieel van gevitrificeerde oöcyten vergelijkbaar is met dat van verse oöcyten, en dat het aannemelijk is dat gevitrificeerde oöcyten beter presteren dan slow-frozen oöcyten. Probleem is wel het kleine aantal studies, de heterogene inclusiecriteria, en het (op één studie na) geringe aantal geïncludeerde patiënten.

In een meta-analyse door Cil (2013 (10)) werd de invloed van de leeftijd van de vrouw op de kans op een levend geboren kind bestudeerd, waarbij embryo's afkomstig van gevitrificeerde dan wel slow frozen oöcyten werden teruggeplaatst. In totaal werden 10 verschillende artikelen geanalyseerd, met in totaal 2.265 cycli van 1.805 verschillende patiënten. Toenemende leeftijd deed deze kans sterk afnemen, zowel bij gebruik van gevitrificeerde als van slow frozen oöcyten. Onafhankelijk van de leeftijd van de vrouw was de kans op een levend geboren kind bij gebruik van gevitrificeerde oöcyten echter bijna twee keer zo groot als bij gebruik van slow frozen oöcyten.

Edgar en Gook (2012 (8)) concluderen dat slow frozen oöcyten gecompromitteerd zijn vergeleken met verse oöcyten, hoewel nadrukkelijk wordt vermeld dat het aantal goed uitgevoerde studies beperkt is. In twee studies die de prestatie van gevitrificeerde en slow frozen oöcyten vergeleken, presteerden gevitrificeerde oöcyten beter op het gebied van overlevingspercentage, bevruchtingspercentage, implantatie kans, en/of klinische zwangerschap, met als kanttekening dat in beide studies niet het (waarschijnlijk) meest optimale slow freezing protocol werd gebruikt.

In een studie door Levi Setti (2014 (11)) werden gedurende 5 jaar (2007-2011) de resultaten van in totaal 109 Italiaanse IVF-centra op het gebied van cryopreservatie van oöcyten (slow freezing (SF) vs. vitrificatie (VT)) bestudeerd. In totaal werden 8.927 SF-cycli vergeleken met 5.401 VT-cycli. Opgemerkt werd dat de variatie in de resultaten van verschillende centra cq. van de verschillende gebruikte protocollen groot was. Tevens bleken er per afzonderlijk jaar bekeken grote verschillen te zijn in de resultaten behaald met beide cryopreservatie technieken. Zo waren de resultaten behaald met slow freezing en vitrificatie in 2010 identiek (zwangerschapskans per cyclus: SF 13,8% vs. VT 13,7%; OR (95%CI 0,99 (0,79-1,25); p=0,958)), terwijl in 2009 vitrificatie nog significant betere resultaten opleverde (SF 12,4% vs. VT 16,5%; OR (95%CI 1,40 (1,14-1,71); p=0,001)). Wanneer de resultaten van alle vijf jaren werden gepoold waren de vitrificatie resultaten significant beter (SF 12.0% vs. VT 14,4%; OR (95%CI 1,23 (1,11-1,35); p<0,001)).

Samengevat: er is een duidelijke tendens richting het gebruik van vitrificatie als optimale cryopreservatiemethode voor oöcyten. Een goed uitgevoerde slow freezing programma geeft echter resultaten die in de buurt van die van vitrificatie lijken te komen. Het is op dit moment dus nog wat te vroeg om slow freezing voor oöcyten geheel af te schrijven.